免疫组化技术操作方法示例

         免疫组织化学技术原理相对简单，而实际操作涉及到的时间较长，环节较多，任何一个环节没有控制好，都可能导致染色结果的不佳甚至失败。下文是一份使用HRP标记非生物素聚合物二抗系统进行石蜡切片免疫组化检测的具体流程，可作为基础参考：

1、预热：打开电热恒温干燥箱电源开关，调节箱内温度至 65℃。
2、标记及烤片：用铅笔在切片的磨砂面做好检测对应标记（组织编号，抗体名称，稀释度，抗原修复方法等）；将切片放入塑料染色架中置于电热恒温干燥箱，在 65℃的条件下烤片 40-60 分钟（建议用温度计监测好温箱实际温度）。
3、脱蜡水化：将组织切片依次置于二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ内分别浸泡 10 分钟，共 30 分钟；梯度酒精（浓度由高到低 100％～100％～95％～75％）各浸泡 2 分钟，共 8 分钟，蒸馏水冲洗 30 秒×2 次。
4、封闭内源性过氧化物酶：将组织切片置于 3％的过氧化氢水溶液（现配现用）中浸泡5min，蒸馏水冲洗 30 秒×2 次。（此步骤也可放在抗原修复之后）
5、抗原修复：根据抗体的不同选择不同的抗原修复缓冲液进行高温抗原修复（并非所有IHC检测都需抗原修复，不需要进行抗原修复的抗体省略此操作）。
      高温抗原修复操作：将切片放入装有抗原修复缓冲液的修复盒中，再把修复盒放入水浴锅中，盖上水浴锅盖子，开始加热；待水沸腾后，开始计时，20 分钟后，停止加热，从水浴锅中取出修复盒，自然降温 20 分钟。
6、划出阻水区域：将切片从修复液中取出， PBS 冲洗 2 分钟×2 次。甩去玻片上的液体，再用吸水纸吸干组织块边缘的液体，用免疫组化笔沿组织切片边缘划出阻水区域（切片量多时，需注意防止切片干片）。
7、一抗孵育：按切片上的标记，对应滴加第一抗体工作液，置于湿盒中室温（15～25℃）下孵育 60 分钟或 4℃冰箱中孵育过夜（具体操作条件参照抗体说明书）。
8、 二抗孵育：PBS 冲洗，3 分钟×2 次；甩去 PBS 液, 滴加二抗 HRP 聚合物试剂：goat anti mouse/rabbit-HRP 聚合物，室温孵育 20-30 分钟。
9、底物显色：PBS 冲洗，3 分钟×3 次；甩去 PBS 液,，滴加 DAB 溶液（浓缩 DAB 试剂盒，提供现配现用）显色；显色时间为 5 分钟；观察显色情况，蒸馏水冲洗终止显色。
10、 苏木素复染：甩去切片表面多余的液体，滴加苏木素染液染色 2 分钟，自来水冲洗3 分钟；蒸馏水冲洗 30 秒。
11、 脱水、透明、封片：切片依次在梯度酒精（浓度由低到高 75％～95％～100％）中各浸泡 2 分钟，共 6 分钟；在二甲苯中浸泡 3 分钟。使用环保封片剂进行封片（此步也可视情况采取干封操作），封片后的切片置于塑料晾片板中。
12、 观察结果：显微镜下观察观察切片的 免疫组化 染色结果。