高灵敏度免疫组化二抗是可靠检测结果的保障

选择免疫组化二抗至少需要考虑三个方面的因素：

1.      种属匹配性：也就是说一抗如果用的是兔抗人的抗体，那么二抗需要用可以抗兔IgG的二抗；一抗如果用的是小鼠抗人的抗体，那么二抗则需要用可以抗小鼠IgG的二抗。

2.      检测特异性：通俗的说，就是不会把无关蛋白识别成阳性。比如使用一个标记血管内皮的一抗，如果你用某二抗配合检测后，发现不单血管内皮上有着色，其他一些无关细胞的蛋白（如上皮、肌肉组织等）也出现阳性着色，说明检测结果存在特异性问题。使用高纯度抗体原料制备的二抗的特异性会明显优越。

3.      检测灵敏度：组织和细胞内真实存在的蛋白，可以多大程度的被检测出来。由于免疫组化的结果是可以观察到组织和细胞结构的，如果二抗系统的检测灵敏度不足，也可以从结果中看出来。例如错配修复蛋白系统 (MLH1 MSH2 MSH6 PMS2)等的这些蛋白在各正常组织和细胞的核内普遍表达，如果某二抗检测系统仅能检测到50%的细胞的阳性表达，说明这个二抗系统的灵敏度是有问题的。

对于第1个因素，绝大多少科研人员一般都不会选错，如若选错则二抗和一抗结合不上，会出现假阴性结果。

对于第2个因素，和一抗的特异性关系大一些，和二抗也有关系。所以没有明确标示可以用于免疫组化组织检测的二抗，不要用于做免疫组化——即不是各种酶标二抗都可以做免疫组化。比如二抗说明书上说可以用于做ELISA但没有写出可以做IHC(免疫组化)的二抗，如果贸然用于做免疫组化，很可能会出现大范围的非特异显色的结局。另外，在组织中做免疫组化时，需注意避免使用含生物素标记的二抗系统(SP法，ABC法等)，而需要使用聚合物非生物素的二抗系统，从而避免内源性生物素对结果的干扰。如果在特异性这个方面出现问题，其结果往往会出现一些和文献上列出的不一致的非特异着色，甚至是广泛的背景着色，从而难于提取出好的结果图片，所以相对而言还是比较容易发现的。

对于第3个因素，是最容易被忽视的因素，往往很晚才发现。如果在免疫组化过程中，一抗浓度已经用到了说明书里面推荐的较高浓度但仍然在可靠的阳性对照组织中不能得到较明显的阳性结果，其实就需要引起警惕。

由于第3个因素处理不当造成的不良结果有相当大的隐蔽性，并不容易很快能发现——即其结果有阳性出来，背景也还不错，可能会被误认为一个理想的结果开始把这个结果写入研究论文，而在科研论文投稿后，被审稿老师发现后才被退回，导致重新选材选试剂补实验的被动局面。这样的话就非常浪费时间浪费精力，对科研人员及其课题损害很大。因此我们着重讨论一下这个免疫组化检测灵敏度因素。

按照可用于做组织的免疫组化二抗的灵敏度的高低，可以将免疫组化二抗分为以下几类：

一，单酶标二抗：即一个抗体上仅偶联了一个酶。这种单酶标二抗制备比较简单，应用也比较广泛，很多ELISA实验的二抗用的就是单酶标二抗。对于检测组织样本而言，这种二抗灵敏度过低，并不推荐使用。有些单酶标二抗的说明书上可能写着，本产品可用于ELISA，也可以用于IHC。但我们要清楚，可用和适用是不同的。单酶标二抗过低的检测灵敏度会导致较高的假阴性率，特别是对于一些原本在组织和细胞中表达就不太高的蛋白就影响更加明显了。

二，聚合物二抗(单试剂，仅含聚合物二抗成分)：为了避免组织内源性生物素对结果的干扰，非生物素的聚合物二抗系统后面才被研发出来（2000年前后）。聚合物二抗系统由于使用了聚合物骨架将较多的酶和抗体偶联到了骨架上，因此其检测灵敏度远高于单酶标二抗，稍高于SP等生物素二抗。这种二抗由于检测灵敏度较高，并且没有生物素的干扰而被广泛使用。如果目标蛋白不是含量过低，这种单试剂聚合物二抗已经是够用的。但对于某些含量比较低的检测靶标，仍然需要更高灵敏度的二抗检测系统才能保证结果的准确性。

三，聚合物二抗（双试剂，含试剂A 增强剂和试剂B聚合物二抗）：这种二抗在加入聚合物二抗前，加入一个作用为促进或优化二抗结合的“增强剂”，这个增强剂的实质是一种连接子，也被称为“Linker”。这种双试剂的聚合物二抗灵敏度比单试剂的聚合物二抗又有了相当的提升。对于一些表达比较丰富，比较容易检测的蛋白，可能单试剂和双试剂聚合物二抗两者的差异并不明显，因为蛋白丰度高连接点已经足够多，并不需要过多的增强剂加强连接来提高灵敏度。但是，对于一些表达量低，检测困难的蛋白，则两者的差异非常明显。

下面是国际IHC质控组织关于不同灵敏度二抗对MLH1蛋白的检测效果对比的示意图：

左图用的是高灵敏度的双试剂的聚合物二抗，结果评估为优秀；右图用的是一般灵敏度的单试剂聚合物二抗，结果评估为不合格。

MLH1蛋白作为错配修复系统的一员，在各种组织中广泛表达，但在相当一部分细胞上表达的丰度并不高。所以右图中部分区域的淋巴细胞阴性，并非真阴性，而是因为二抗系统的灵敏度不够所致的结果。

所以，根据目标蛋白的表达丰度，选择合适灵敏度的二抗，对取得可靠的实验结果是非常重要的！有些科研人员只是偶尔做一下免疫组化，并不太清楚怎样选择才好。那么可以简单的说，优选高灵敏度的双试剂聚合物二抗系统：因为这决定整个检测系统的灵敏度顶点，兼容性比较好，比较保险。

另外，即使选用双试剂的聚合物二抗系统，也是需要注意，有些厂家提供的此类试剂是仅增强对小鼠一抗的检测灵敏度的，对兔一抗却效果不明显；有些则增强对兔一抗的检测灵敏度，对小鼠一抗的则效果不明显。因为小鼠和兔都是最常见的一抗种属来源，最优选择当然是选用同时对小鼠和兔来源一抗的检测灵敏度都有明显提高的平衡双增强型的产品。

医本生物具备自主的聚合物二抗的核心技术，提供的编号为MD017的双试剂聚合物二抗（双增强型HRP标记羊抗小鼠/兔聚合物二抗）就是此类的双增强型的聚合物二抗，同时增强对小鼠和兔来源一抗的检测灵敏度。优选全球范围内的高品质原料，通过医本生物自主掌握的核心聚合物偶联工艺技术，已经在国内实现了批量生产。经过两年来的众多用户的反复使用及验证，反馈良好，广受欢迎！

在实现良好的使用效果的同时，医本生物可以提供更优惠的价格，更快的供货速度，以更好的满足广大科研工作者的使用要求并降低使用风险。

下面是一些第三方专业机构对医本MD017平衡双增强型的聚合物二抗对比测试的代表性反馈：

可见作为待测试剂的医本生物MD017二抗在与对照的进口同类聚合物二抗试剂平行对比时，仍可比其更优越。

另外有一个值得一提的反馈案例是：某测试单位为测试二抗系统的检测灵敏度，将MSH6一抗稀释度提高到1:1000(推荐稀释度为1：100-200)，与其他供应商的同类二抗试剂进行平行对比（医本双增强二抗VS国内其他单位提供的双增强二抗），结果的差异很明显：

对照双试剂聚合物二抗试剂测试结果

医本MD017二抗测试结果

由上面两张结果图对比可见，在其他条件一致仅二抗不同的测试情况下，医本MD017双增强型的聚合物二抗测试效果明显优于对照的同类试剂：

1.      阳性强度：医本MD017二抗染色的核阳性明显强于对照试剂，并且保持良好的着色形态；

2.      阳性细胞数：医本的明显比对照试剂的多，按MSH6的表达特点，医本的阳性细胞数更符合实际情况；

3.      染色背景：对照试剂背景较明显，除了核阳性着色外，间质和一些细胞胞浆也有背景着色；而医本的则核阳性明显，其他部位基本上没有背景，对比鲜明。

可见，即使号称是同类的双试剂聚合物二抗产品，质量上仍然差异明显。

前面的是医本双试剂聚合物二抗（已有增强剂发挥增强作用）和其他同类产品的对比；而通过医本双增强二抗（上图）在与国内其他单位提供的单试剂的聚合物二抗（无增强剂效应）进行对比时（下图），可以发现两者的差距更加明显！

这张结果图是在相同的组织上（切片虽然隔开了几张的距离，但仍然是同一部位对比），一抗浓度等的条件不变，当使用国内其他单位提供的单试剂聚合物二抗测试时，可见不但阳性较弱，而且出现了较多的假阴性染色细胞（含有MSH6蛋白，但没有被检测出来，细胞核无阳性着色）。

通过上述明确的对比，可见使用高灵敏度的免疫组化二抗对得到可靠的实验结果非常重要！

为方便科研工作者小批量的购买需求，医本生物可提供以下各种规格的MD017双增强型的聚合物二抗：

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